最近研究，癌變過程中發生的最典型的表觀遺傳修飾是抑癌基因啟動子區域CpG島的甲基化，調控該基因的表達量，若高度甲基化，基因甚至會沉默不表達，等效于基因發生突變或缺失而失活，這也有專家提出抑癌基因甲基化參與腫瘤發生的二次打擊。近年來，CFDA也批準了若干個癌癥的基因甲基化產品，包括腸癌、肺癌等，直至2022年8月，國家藥監局才發出宮頸癌甲基化相關的第一張注冊證。接下來我們討論DNA甲基化作為女性腫瘤早期檢測標記物的前景，及存在哪些方面的挑戰。

 

一、討論女性腫瘤篩查與診斷的現狀

 

女性主要的腫瘤包括乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和子宮內膜癌。宮頸癌由于病因明確，癌癥發生發展機制清楚，是WHO唯一推薦篩查的惡性腫瘤，有著規范的三階梯診療模式，并且湘雅醫學檢驗所推出的PAX1基因甲基化檢測已廣泛應用于臨床。所以這里主要討論乳腺癌、卵巢癌和子宮內膜癌，雖然這些癌癥都存在現有的篩查、診斷和治療模式，但發病率和死亡率都很高，防治仍具挑戰。

 

乳腺癌（BC）是女性最常見的癌癥，每8名女性中就有1人患此病。鉬靶X線或超聲成像進行篩查，過度診斷是一個日益嚴重的問題，另外通過鉬靶X光檢查發現BC的婦女中，只有3% -13%的治療效果得到改善[1]。

 

卵巢癌（OC）發病率低，但在早期，婦女大多無癥狀或有些非特異性的癥狀，使診斷就非常困難，目前尚無有效的篩檢方法。陰道超聲檢查TVS是一種高靈敏度診斷方法。然而，它高度依賴于個人的專業知識[2]。

 

子宮內膜癌（EC）是最常見的婦科惡性腫瘤，EC若能早期診斷，是可以治愈的，目前沒有建議常規篩查[3]。

 

結合來看，臨床亟需新的標記物幫助解決女性腫瘤良惡性難區分、早期難發現、預后評估等問題。

 

二、了解DNA甲基化的癌癥標記物

 

許多研究顯示，甲基化特征幾乎可以在任何體液（血清/血漿、涂片、乳頭分泌物和陰道分泌物等）中檢測到。血樣可通過微創方式獲得，并為DNA甲基化分析提供理想的樣本。循環游離DNA在健康人血液中的平均濃度為30ng/ml。如果我們假設一個正常細胞的DNA含量為6.6 pg，這意味著平均每毫升血液中有5000個基因組的量。在癌癥患者中，腫瘤DNA被死亡的癌細胞釋放到血液中，血清中cfDNA的平均濃度較高，約為180 ng/ml[4]。

 

                      


血清中腫瘤特異性DNA甲基化分析具有許多優勢[5]：

 

1.靈敏度高

cfDNA容易PCR擴增，提高敏感度具有潛在可能性；

 

2.假陽性低

在一個特定基因上獲得甲基化后，甲基化模式通常在疾病進展過程中相對保守；

 

3.陽性信號

DNA甲基化是可檢測的陽性信號，而不是信號丟失，如染色體缺失；

 

4.穩定性高

異常DNA甲基化具有化學和生物學穩定性，相對不受生理狀態和樣品采集條件的影響；

 

5.操作性強

實時定量PCR的基因特異性分析很容易適應診斷實驗平臺，并且該方法的分析靈敏度和特異度非常高。

 

6.設計簡單

基因啟動子CpG島高甲基化的選擇比可能分散于基因的遺傳改變（基因突變）具有優勢。

 

由于DNA甲基化分析技術上的困難，目前只有少量DNA甲基化標記，比如HOXA9基因甲基化標記的問題出現在信噪比低，也就是正常細胞游離DNA非常多而癌癥特異性信號非常少。現在由于技術的突破這已經不是問題，可以用dmPCR和NGS等手段來檢測。

 

三、甲基化檢測技術實現臨床轉化的橋梁（B2B：Bench to Bedside）

 

甲基化特異性PCR (methyl- specific PCR, MSP)是一種相對簡單的方法，定性多于定量的。設計了兩套靶區引物，一套擴增甲基化模板，另一套擴增亞硫酸氫鹽轉化后的未甲基化模板。與實時PCR相比，一種更為靈敏的方法是將數字PCR與MSP結合使用，這種方法被稱為digital MethyLight（dmPCR）。由于數字PCR通常不受PCR效率差異的影響，并且能對DNA模板進行絕對定量，因此與實時PCR相比，數字PCR具有更好的敏感性和特異性。

 

 

 

臨床檢驗的特異性需要充分考慮癌癥類型和臨床分期。在BC病例中，乳房鉬靶X線篩查的過度診斷是一個令人擔憂的問題，那么生物標志物確定預后不良的癌癥，并將其與預后良好的癌癥以及良性腫瘤進行區分。相比之下，OC的臨床檢驗則需檢出所有的病理類型。在標記物開發階段，組織學分類對于解釋甲基化模式的可變性是重要的，從而可以統計分層提高性能指標。尋找共同的甲基化模式而不是對比的模式可能是一個更有效的策略。

 

即使在最佳條件下，也不太可能有單一的標記能夠滿足人群早期檢測OC的高特異性要求。可能的解決方法是建立一個多因素分析方法，多個甲基化位點或甲基化與基因組標記的結合。但這樣的組合，靈敏度和特異性就需根據臨床有所取舍，同時在開發、測試階段都應仔細測試，開發難度增加。

 

四、總結

 

生物標志物開發進展緩慢一直是一個主要問題，其兩大挑戰是缺乏適當的技術和對疾病過程的深入了解。甲基化基因芯片和亞硫酸氫鹽測序的幫助，我們可以找到合適的分子標記物，關鍵生物標記物將能夠發現早期癌癥或癌化病變，并且能夠加深對腫瘤/癌癥發生的認識。另一方面，也要有適應臨床的技術能夠將生物標志物的發現轉化為臨床可行的癌癥血液基因甲基化早篩和輔助診斷。基因甲基化這個領域正在進行的研究有可能改進對所有主要女性癌癥的診斷和治療監測。

 

1. Welch, H.G. and B.A. Frankel, Likelihood that a woman with screen-detected breast cancer has had her "life saved" by that screening. Arch Intern Med, 2011. 171(22): p. 2043-6.

 

2. Yazbek, J., et al., Effect of quality of gynaecological ultrasonography on management of patients with suspected ovarian cancer: a randomised controlled trial. Lancet Oncol, 2008. 9(2): p. 124-31.

 

3. Siegel, R., D. Naishadham, and A. Jemal, Cancer statistics, 2013. CA Cancer J Clin, 2013. 63(1): p. 11-30.

 

4. Gormally, E., et al., Circulating free DNA in plasma or serum as biomarker of carcinogenesis: practical aspects and biological significance. Mutat Res, 2007. 635(2-3): p. 105-17.

 

5. Wittenberger, T., et al., DNA methylation markers for early detection of women's cancer: promise and challenges. Epigenomics, 2014. 6(3): p. 311-27.